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膜蛋白抽提试剂盒
产品名称：膜蛋白抽提试剂盒

产品货号：KGP350
规格包装：50T
品牌产地：南京凯基
产品价格：580元

膜蛋白抽提试剂盒

产品名称
规格
货号
品牌
价格
膜蛋白抽提试剂盒
50T
KGP350
南京凯基
580
100T
KGP3100
南京凯基
980
NE-PER(R)  Eukaryotic Membrane Protein Extraction
Kit
89826
Pierce
2666

 
凯基膜蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
Cat Number：      For Research Use Only
Store at -20℃ for one year
Expire date：                                                                    

一、   试剂盒说明
 本试剂盒提供独特的组份提取细胞及组织中的膜蛋白。其原理是裂解细胞后，先离心分离出质膜粗提物，再利用特殊的抽提Buffer，选择性地分离提取膜蛋白，抽提Buffer含一种特殊的去污剂，在4℃时所有的蛋白质均可都溶于抽提Buffer，但在37℃时，抽提Buffer分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中，根椐该性质分离出膜蛋白。产物不仅含细胞膜蛋白，也含胞器质膜蛋白。提取方法简单，可靠，快速。获得的膜蛋白纯度高，可用于PAGE电泳、 Western Blot、免疫共沉淀等后续研究。
二、   试剂盒组份
组份
KGP350（50 tests）
KGP3100（100 tests）
储存温度
Lysis Buffer
50 mL
25 mL× 4
4℃
抽提Buffer
50 mL
25 mL× 4
4℃
蛋白酶抑制剂
50μL
100μL
-20℃
溶解Buffer
15 mL
30 mL
4℃
TCA试剂
5 mL
10 mL
-20℃
Loading Buffer
1 mL
2 mL
-20℃
DTT(1M)
50μL
100μL
-20℃
三、      操作步骤
Ⅰ 实体组织蛋白的提取
1、组织样本（200～300mg）尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，于冰上剪碎；
2、组织样本中加入1mL Lysis Buffer（注：使用前，每mL Lysis Buffer加入1μL蛋白酶抑制剂和1μL 1M DTT），置玻璃均浆器冰上均质30～50次（或超声破碎细胞，每次30 S，3～4次，每次间隔1 min），置于冰上冷却。均质或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％；
3、将均浆液转移至冷的离心管中，于4℃, 3000 rpm 离心10 min，弃沉淀；
4、取上清转移至新冷离心管中，于4℃, 14 000 rpm 离心30 min，所得上清转至新管中，即为胞浆蛋白，分装冷冻保存；
5、取步骤4离心所得沉淀，加入1mL冷的抽提Buffer，涡旋振荡混匀后，4℃放置10～ 15min；
【注：因抽提Buffer在室温时会分层，请务必于4℃混匀后加入】
6、 4℃, 3000rpm 离心5min，取上清转移至新管（注意勿将沉淀带入上清），进行下步提取；
7、置于37℃水浴10min；
8、室温,13 000rpm离心5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；
【注：建议使用进口透明性较好的微量离心管，可见下层为含膜蛋白的有机相。上下两层因均为透明，只在交界处有一折光线，需仔细观察才可见到。或室温静置30分钟～1小时亦可见分层。以下亦同。】
 
如需更高纯度脂溶性膜蛋白，可选做步骤9-14：
9、取下层，加入500μL冰冷灭菌水，4℃放置5min；
10、置于37℃水浴10min；
11、室温,13 000rpm离心5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；
12、取下层，加入500μL冰冷灭菌水，4℃放置5min；
13、置于37℃水浴10min；
14、室温,13 000rpm离心5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；
15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物，BCA法测定蛋白含量（因残留有机相可能影响测定结果，此含量为相对参考值），分装冷冻保存。
 
Ⅱ 培养细胞蛋白提取
1、收集不少于1×107细胞，用冷PBS （pH7.4）洗涤细胞两次（每次3000 rpm离心5 min）；
2、在细胞样本中加入1mL Lysis Buffer（注：使用前，每mL Lysis Buffer加入1μL蛋白酶抑制剂和1μL 1M DTT），置玻璃均浆器冰中均质30～50次（或超声破碎细胞，每次30 S，3～4次，每次间隔1 min），置于冰上冷却。均质或超声破碎细胞后应镜检，细胞破碎率不小于90％；
3、将均浆液转移至冷的离心管中，于4℃, 3000 rpm 离心10 min，弃沉淀；
4、取上清转移至新冷离心管中，于4℃, 14 000 rpm 离心30 min，所得上清转至新管中，即为胞浆蛋白，分装冷冻保存；
5、取沉淀，加入1mL冷的抽提Buffer，涡旋振荡混匀后，4℃放置10～ 15min；
【注：因抽提Buffer在室温时会分层，请务必于4℃混匀后加入】
6、 4℃, 3000rpm 离心5min，取上清转移至新管（注意勿将沉淀带入上清），进行下步提取；
7、置于37℃水浴10min；
8、室温,13 000rpm离心5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；
【注：建议使用进口透明性较好的微量离心管，可见下层为含膜蛋白的有机相。上下两层因均为透明，只在交界处有一折光线，需仔细观察才可见到。或室温静置30分钟～1小时亦可见分层。以下亦同。】
如需更高纯度脂溶性膜蛋白，可选做步骤9-14：
 
9、取下层，加入500μL冰冷灭菌水，4℃放置5min；
10、置于37℃水浴10min；
11、室温,13 000rpm离心5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；
12、取下层，加入500μL冰冷灭菌水，4℃放置5min；
13、置于37℃水浴10min；
14、室温,13 000rpm离心5min，样品分成上层和下层（含膜蛋白）；
15、最终得到的下层即为膜蛋白提取物，BCA法测定蛋白含量（因残留有机相可能影响测定结果，此含量为相对参考值），分装冷冻保存。
 
SDS  PAGE 电泳操作步骤
1、进行PAGE电泳前，取该提取物，每100μL膜蛋白提取物，加入约300μL的溶解Buffer 和约100μL三氯乙酸 （TCA）试剂，混匀后置冰上20～30 min后， 13 000rpm，离心15 min，尽可能除去上清；
2、沉淀加入1mL丙酮，室温静置10min后，13 000rpm离心15 min；
3、弃上清，沉淀真空旋干或置冰上干燥约10 min（敞开离心管盖），加入适当体积的Loading Buffer（使用前每100μL Loading Buffer加入2～5μL巯基乙醇）溶解，彻底分散（枪头反复吹吸或剧烈涡旋），煮沸5min；【注：加入Loading Buffer后如有部分难溶物，可取上清继续上样；如加入Loading Buffer后溴酚蓝转呈黄色，此为少量TCA残留所致，不影响电泳结果。请参照Marker标准。】
4、上样进行SDS PAGE电泳。
 
四、 注意事项：
 1、所有的试剂及器具均需预冷后使用。细胞或组织量需达到要求。
 2、 抽提Buffer 4℃时，为混悬状态，请于此温度下混匀后吸取加入粗提物中。
3、 室温25℃～37℃时，抽提Buffer需静置30分钟以上可看到分上下两层，其中约9/10至4/5为上层水相，下层只占1/10至1/5为有机相。
4、 因产品采用不透明的包装瓶，因此无法观察到上述分层现象，可将该BUFFER倒入玻璃烧杯或试管中静置30分钟～1小时可见分层。