核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
产品名称:核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒

产品货号:KGP150
规格包装:50T
品牌产地:南京凯基
产品价格:480元

产品名称
规格
货号
品牌
价格
核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
50T
KGP150
南京凯基
480
100T
KGP1100
南京凯基
880
NE-PER(R) Nuclear and Cytoplasmic Extraction
50T
78833
Pierce
2586
250T
78835
Pierce
6863

 

凯基核蛋白和胞浆蛋白提取试剂盒
Cat Number               For Research Use Only
Store at -20℃ for one year                                                                 
 
一、   试剂盒说明
本试剂盒用于从哺乳动物组织和培养细胞中提取核蛋白和/或胞浆蛋白,提取制备过程简便。制备的核蛋白和胞浆蛋白能保持天然活性,并且纯度较高。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究。
二、   试剂盒组份

组份
KGP150 (50 test)
KGP1100(100 test
储存温度
Buffer A
 25 mL
25 mL ×2
4
Buffer B
 1.5 mL
3.0 mL
4
Buffer C
12.5 mL
25 mL
4
DTT
50μL
100μL
-20℃
蛋白酶抑制剂
250μL
500μL
-20℃
PMSF100mM
400μL
800μL
-20℃

三、操作步骤
Ⅰ 实体组织蛋白的提取
1、   组织样本,将组织剪切成小块,加入适量的冰冷PBS均浆后,静置5 min ,弃沉淀,小心吸取上清转移至另一离心管中;
2、   上清4℃离心500×g,3 min,弃上清,估计细胞压积PCV(离心后的紧实细胞体积);
3、   每20μL细胞压积中,加入200μL预冷的Buffer A【使用前每mL Buffer A加入1μL DTT,5μL 100mM PMSF,5μL蛋白酶抑制剂】,最大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上10~15min;
4、   加入11μL冷Buffer B,最大转速涡旋剧烈振荡5s,放置冰上1min;
5、   再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后, 4离心,16000×g,5min;
6、   尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管,置于冰上,即得胞浆蛋白;
7、   在离心沉淀物(细胞核)中加入100μL预冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1μL DTT,5μL 100mM PMSF,5μL蛋白酶抑制剂),最大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上40min,每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds;
8、   4离心,16000×g,,10min,尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管,即得核蛋白;
9、   上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量(Braford法或BCA法),分装并保存于-80℃,避免反复冻融。
Ⅱ 培养细胞蛋白提取
1、   取培养细胞5×106~1×107个/mL,4℃离心,500×g,3 min收集细胞,弃去培养液,用预冷的PBS洗涤两遍;
2、   用移液枪尽可能取去上清,勿留残液,估计细胞压积PCV(离心后的紧实细胞体积);
3、   每20μL细胞压积中,加入200μL预冷的Buffer A【使用前每mL Buffer A加入1μL DTT,5μL 100mM PMSF,5μL蛋白酶抑制剂】,最大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上10~15min;
4、   加入11μL冷Buffer B,最大转速涡旋剧烈振荡5s,放置冰上1min;
5、   再次最大转速涡旋剧烈振荡5s后, 4离心,16000×g,5min;
6、   尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管,置于冰上,即得胞浆蛋白;
7、   在离心沉淀物(细胞核)中加入100μL预冷的Buffer C (使用前每mL Buffer C加入1μL DTT,5μL 100mM PMSF,5μL蛋白酶抑制剂),最大转速涡旋剧烈振荡15s,放置冰上40min,每间隔10 min涡旋剧烈振荡15 seconds;
8、   4离心,16000×g,,10min,尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管,即得核蛋白;
9、   上述提取的胞浆蛋白和核蛋白进行蛋白定量(Braford法或BCA法),分装并保存于-80℃,避免反复冻融。
四、     注意事项
1、 所有的试剂及器具均需预冷后使用;
2、 细胞的数量不应少于0.5×107个/mL;,
    3、 以上各缓冲液的使用量是以20μL细胞压积为例,如细胞压积不同,请参考下表加入各缓冲液。

细胞压积PCV
Buffer A
Buffer B
Buffer C
10μL
100μL
5.5μL
50μL
20μL
200μL
11μL
100μL
50μL
500μL
27.5μL
250μL
100μL
1mL
55μL
500μL

    4 一般常规提取的蛋白样品,进行后续试验不需要透析,但如果需要较大量的提取蛋白或后续试验结果不理想,则需要将提取的蛋白样品进行透析脱盐,建议使用凯基透析Buffer (Cat: KGB—P001)透析后进行后续分析。